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发布日期:2019-11-29

纪念斯隆·凯特琳癌症中心(mskcc)和grail联合研究团队,今天带来一项重要研究成果。

这项由mskcc实验病理学主任jorgereis-filho和临床医学科学家pedram razavi共同领导的研究,对124例癌症患者的cfdna、肿瘤组织样本和白细胞dna,以及47名无癌志愿者的cfdna和白细胞dna,进行了超高深度测序(60000×)。

他们发现,肿瘤患者血液cfdna中携带的大部分基因突变,可能不是来自于癌细胞,而是血液中白细胞。

具体说来,在癌症患者的cfdna中,克隆性造血带来的变异可能占53.2%;而在健康的志愿者体cfdna中,这一数字能达到81.6%。这意味着,克隆造血带来的突变比科学家原来认为的要常见的多。

“看到这个结果,我们差点儿从椅子上掉下去。”reis-filho[1]

这也给液体活检相关的研究提出了挑战,在给患者开展液体活检时,白细胞dna应该是必检项目,甚至需要开展超高深度的测序。

pedram razavidavidn. brown和华人科学家bob t. li是共同第一作者。研究论文发表在顶级期刊《自然·医学》上[2]

▲ 从左到右:pedram razavijorge reis-filhobob li(图源:mskcc

我们都知道,随着人体各种细胞的死亡破裂,细胞的dna会释放到血液中,这些dna就构成循环游离dnacfdna)。同理,肿瘤细胞也会死亡,并往血液中释放游离dna,这就是我们所熟悉的循环肿瘤dnactdna[34]。很显然,ctdna只是cfdna中带有基因变异的那一小部分[5-7]

ctdna的发现,让科学家对癌症的液体活检技术寄予厚望。

虽然科学家想到了很多方法研究ctdna[8-10],但是仍难摆脱多种混杂因素的影响[11]

其中影响比较大的一个是克隆性造血。

克隆性造血是那些有基因突变的造血干细胞,通过多系造血分化,形成携带同样突变的终末分化成熟血细胞[12]。虽然其中一些突变会导致后代血细胞具备适应性优势,出现不成比例的扩增[13],但是这种克隆性扩增并不是恶性的。

克隆性造血会随着年龄的增长而增加,之前有研究表明31%的老年人都会出现克隆性造血[14]。而且,导致克隆性造血的基因突变,也可以通过cfdna检测到[15]

reis-filho等认为,克隆性造血肯定会影响肿瘤学家对cfdna测序结果的解释,尤其是很大一部分cfdna片段源自造血细胞[16]

▲ 图片来自pixabay.com

尽管大量的研究表明,通过cfdna检测到的基因突变,与通过肿瘤组织检测到的基因突变有很好的一致性[10]。不过,还是有科学家在cfdna中发现了很多肿瘤组织中不存在的基因突变[6]。当然啦,这部分突变有可能是因为组织活检取样的不全面带来的,也有可能是克隆性造血导致的。

关于这个问题,reis-filho等认为需要好好研究一番。

20159月到20168月之间,研究人员一共招募了124名晚期未经治疗或者进行性转移的癌症患者,其中乳腺癌(mbc)患者39名,非小细胞肺癌(nsclc)患者41名,前列腺癌(crpc)患者44名。另外还招募了50名没有癌症的志愿者,作为对照样本,不过最终只有47名无癌志愿者的样本有评估价值。

研究人员从癌症患者身上获取了肿瘤组织样本、cfdna和白细胞dna,从无癌志愿者身上获取了cfdna和白细胞dna样本。

获取样本之后,他们基于已经获得fda批准的msk-impact平台,给每个样本独立开展了深度高达60000×的测序(这个测序深度,成本该有多高……)。

▲ 实验流程图

从总体上看,基于肿瘤组织的活检发现了740个突变,基于cfdna的检测包含其中的53071.6%)。具体到各个癌种的话,比例也是类似的,乳腺癌72%,非小细胞肺癌和前列腺癌是71%

而且,在cfdna发现的基因突变中,有一些突变虽然在肿瘤组织检测中出现,但是频率极低,还有一些在肿瘤组织和白细胞中均没有出现过(研究人员把它们叫做vusos)。

在确定了他们这个高深度测序方法的准确性和敏感性之后。研究人员推测,那些在肿瘤组织和白细胞中均没有出现过突变,可能反应了肿瘤的进化和异质性。而携带这部分变异的肿瘤组织,可能没有被活检采集到。

通过以上数据,我们不难发现,cfdna检测和基于组织的活检还是存在一定的差异的。

cfdna检测的主要基因突变分析

紧接着,研究人员又开展了一项探索性分析:是否可以通过cfdna评估tmb、肿瘤突变特征和msi

分析发现,肿瘤组织活检发现了6个高tmb的样本,其中4例样本也被cfdna判定为有高tmb。不过,cfdna还判定另外6个样本为高tmb样本,但是肿瘤组织检测结果不支持cfdna的结果。

cfdna确定的10个高tmb样本中,有75%的突变是在肿瘤组织中出现频率低,以及在肿瘤组织和白细胞中均没有出现过的。据此,研究人员进一步推测,这可能确实是肿瘤的空间异质性导致的,它们只在一些部位出现超突变,而这个部位恰恰没有被组织活检取到样。随后的基因分析也从侧面佐证了上述结果。

总结以上数据,研究人员认为,cfdna测序可以准确检测整个肿瘤基因组中很大一部分的突变,或许可以反映患者肿瘤的tmb、肿瘤突变特征和msi。而且,cfdna可以检测到肿瘤组织活检发现不了的亚克隆突变。

tmb分布图

随后,研究人员又分析了cfdna检测到的突变生物学来源。在无癌的志愿者样本中,cfdna检测到的突变(364),有81.6%297)出现在了白细胞dna中;而在癌症患者群体中,cfdna检测到的1727个突变,有53.2%918)出现在了白细胞dna中。

并且通过一系列的分析,研究人员认为,通过cfdna进行超高深度测序发现的基因突变,不太可能是技术本身带来的假阳性。而且,之前研究中开展的的白细胞dna低深度测序[1417-20],可能大大低估了克隆性造血的普遍程度。

总之,在reis-filho团队看来,他们提出的这种超高深度cfdna测序分析,确定克隆性造血突变是cfdna中非肿瘤突变的最可能来源。而且这个比例相当惊人,至少在这个研究中,93.6%的无癌志愿者的白细胞携带一个克隆性造血突变,而这一比例在癌症患者群体中竟高达99.1%

▲ 实验设计过程图

最后,论文作者在文章的讨论部分指出了一个有趣的现象。他们认为,当前大多数临床的cfdna检测,都没有同时检测白细胞的dna。结合着这个研究成果来看,这种不同时检测白细胞dna的做法,肯定是不合适的。

不过,我今天特地了解了几个国内头部肿瘤测序公司的情况,基本都在检测cfdna的同时,检测了白细胞的dna,只是测序深度远低于mskcc这个研究。

无论如何,这个研究一方面证明了cfdna检测相较于组织活检的优点,另一方面也警示相关研究人员,在检测cfdna的同时,一定要检测白细胞的dna,最好是超高深度测序。

参考资料:

[1].https://www.mskcc.org/blog/many-mutations-detected-liquid-biopsy-tests-do-not-come-cancer-cells-msk-study-finds

[2].razavi, p., li, b.t., brown, d.n, etal. high-intensity sequencing reveals the sources of plasma circulating cell-freedna variants[j]. nature medicine, 2019. doi:10.1038/s41591-019-0652-7

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(来源于: 奇点糕奇点网)